大鼠血浆(ACD抗凝)分离及操作标准流程:

欧玛仕生物大鼠血浆ACD抗凝分离及操作标准流程本流程适用于大鼠外周血采集后ACD抗凝血浆的分离、处理、保存与使用，核心原则为全程低温操作、避免溶血、减少血浆活化，保证血浆样本的完整性和实验有效性，ACD抗凝剂与大鼠全血推荐配比为1:6(v/v)(ACD抗凝剂1份+全血6份)。

一、实验前准备

1.试剂与耗材

ACD抗凝剂(常规配方：柠檬酸2.45g+柠檬酸钠3.82g+葡萄糖1.47g，加超纯水定容至100mL，0.22μm滤膜无菌过滤，4℃保存，有效期1个月)；

无菌一次性采血管(提前加入定量ACD抗凝剂，真空采血管可直接选用ACD抗凝型)、1mL/2mL无菌一次性注射器、无菌离心管(1.5mL/2mL，提前4℃预冷)；

冰袋、低温离心机、无菌镊子/剪刀、75%医用酒精、无菌棉球、止血棉片。

2.仪器预调试

低温离心机提前预冷至4℃，设置离心参数备用；

操作台用75%酒精擦拭消毒，超净工作台内操作(无菌要求实验)。

3.动物准备

大鼠提前适应性饲养，采血前禁食不禁水4~6h(根据实验需求调整，非必需项)，减少血液中脂类干扰；体重建议200~300g，保证采血量。

二、大鼠采血与ACD抗凝处理

1.采血方式(常用2种，按需选择)

方式1：眼眶静脉丛采血(适用于少量多次采血，单只可采0.5~1mL)

大鼠固定，用75%酒精棉球擦拭眼眶周围皮肤消毒；

无菌毛细管/注射器沿眼眶内侧静脉丛缓慢采血，避免刺破血管壁导致组织液混入(溶血)；

血液直接采集至预加ACD抗凝剂的无菌采血管中，边采血边轻轻颠倒采血管3~5次，使抗凝剂与全血充分混匀。

方式2：腹主动脉/股动脉采血(适用于一次性大量采血，单只可采5~8mL)

大鼠麻醉后(乙醚吸入/腹腔注射麻醉剂)，仰卧固定，腹部/大腿根部用75%酒精消毒；

无菌操作下剪开皮肤，分离腹主动脉/股动脉，用注射器穿刺采血，血液快速注入ACD抗凝采血管；

采血后立即轻摇采血管5~6次，混匀抗凝剂，全程将采血管置于冰浴中，避免血液凝固。

2.抗凝关键要点

严格控制ACD抗凝剂与全血比例，比例过高会稀释血浆，比例过低会导致血液凝固，无法分离血浆；

采血后30min内完成抗凝混匀与后续离心，避免血液在室温下放置过久。

三、血浆分离(核心步骤，全程冰浴/4℃操作)

将混匀后的ACD抗凝全血采血管继续置于冰浴中平衡10min，使抗凝反应充分；

若采血管中有血凝块/杂质，用无菌吸管轻轻挑出(避免挤压血凝块导致溶血)；

将抗凝全血缓慢转移至提前4℃预冷的无菌离心管中，避免剧烈震荡(防止红细胞破裂)；

低温离心机中4℃离心，参数设置：3000×g，离心15min(无低温离心机时，需在离心杯周围放置冰袋，保证离心过程低温)；

离心结束后，离心管内分为三层：上层淡黄色透明血浆、中层白色血小板层、下层深红色红细胞层，避免触碰血小板层和红细胞层。

四、血浆吸取与分装

超净工作台内(或无菌操作台)，用无菌移液枪(配无酶吸头)沿离心管壁缓慢吸取上层血浆，从液面上方开始，逐滴转移至新的4℃预冷无菌离心管；

吸取至剩余约0.2mL血浆时停止，防止红细胞混入导致溶血，若血浆出现粉红色/红色，判定为溶血，该样本舍弃；

血浆按实验需求分装(如100μL/200μL/500μL/管)，分装后立即用封口膜密封离心管，做好标记(大鼠编号、采血日期、抗凝剂类型、血浆体积)。

五、血浆保存

根据实验使用时间选择保存方式，避免反复冻融(反复冻融会破坏血浆中蛋白、酶、因子等活性)：

短期使用(1周内)：4℃冷藏保存，置于冰箱冷藏层，避免温度波动；

中期使用(1~3个月)：-20℃冰箱冷冻保存，单管单次使用量分装，防止冻融；

长期使用(3个月以上)：-80℃超低温冰箱保存，可加入终浓度0.1%~0.5%的叠氮钠(防腐，实验有蛋白/酶活性要求时禁用)，或液氮冻存(更适用于珍贵样本)；

样本转运：用干冰包裹分装后的血浆管，全程保持冻存状态，避免常温暴露。

六、血浆解冻与使用

冻存血浆缓慢解冻：4℃冰箱冷藏解冻(推荐，可最大程度保留血浆成分活性)，或室温快速解冻(紧急实验用，解冻后立即置于冰浴)；

解冻后轻轻颠倒离心管3~4次，使血浆混匀，切勿剧烈震荡；

解冻后的血浆需当天使用完毕，未用完部分不可再次冻存，直接舍弃；

实验前可将血浆在4℃下3000×g离心5min，去除解冻后可能出现的微量沉淀，取上清使用。

七、注意事项(重点)

防溶血：全程避免剧烈震荡、反复冻融、高温环境，采血时避免组织液、水分混入全血，离心速度不可过高(超过5000×g易导致红细胞破裂)；

无菌操作：若血浆用于细胞培养、酶活检测、免疫相关实验，所有耗材需无菌、无酶，操作在超净工作台内进行，防止微生物污染；

抗凝剂质量：ACD抗凝剂需现配现用(或无菌过滤后短期保存)，避免变质，若出现浑浊、沉淀则禁用；

动物伦理：采血操作符合动物实验伦理要求，眼眶采血避免过度操作导致大鼠受伤，腹主动脉采血后建议安乐死，减少动物痛苦；

样本标记：每一步操作做好清晰标记，避免样本混淆，低温保存的样本管建议使用耐低温标签(普通标签易脱落)。

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